New Phytol. | 农科院作物所何中虎团队在小麦春化开花研究方面取得重要进展

背景：小麦春化特性是决定其适应性的关键，对产量和栽培方式有重要影响，因此研究春化反应的分子机理对小麦品种改良意义重大。小麦的春化特性主要由TaVrn1控制（参见我们公众号之前整理的：小麦春化研究大礼包），其编码一个MADS家族转录因子（MADSTF），MADSTF通常形成异源或者同源二聚体（或者四聚体）调控下游基因的表达(deFolteretal.,2005)。前期我们通过酵母双杂交实验，筛选到了一个TaVrn1互作蛋白TaVrt2(Caoetal.,2013)。TaVrt2也是一个MADSTF，并与拟南芥开花抑制因子SVP同源，但其在小麦中的生物学功能存在争议。TaVrt2最初被认为和SVP一样是开花抑制因子(Kaneetal.,2005;Kaneetal.,2007)，后来的研究显示TaVrt2不抑制开花(DubcovskyJetal.,2008)，但TaVrt2的具体功能及其与TaVrn1互作的生物学意义尚不清楚。最近在NewPhytologist上发表了题为TaVrt2,anSVP-likegene,cooperateswithTaVrn1toregulatevernalization-inducedfloweringinwheat的文章，就此问题进行了深入研究，主要结果如下。

1.TaVrt2是一个春化途径上的开花促进基因

通过农杆菌介导转化在冬小麦品种科农199（KN199）中创制了TaVrt2过表达转基因系（TaVrt2-OE）。在完全春化的条件下（春化30d）TaVrt2-OE和转基因阴性植株（TNL）或者野生型植株（WT）无显著差别；不春化（春化0d）或者不完全春化条件下（春化10d），TaVrt2-OE的开花期都显著早于TNL或者WT（图1），说明TaVrt2是春化途径上的开花促进因子。

图1TaVrt2过表达促进开花

A,C,E分别统计比较了在春化0d（A）、10d（C）和30d（E）条件下TaVrt2-OE与转基因阴性株系（TNL）和野生型（WT）植株的开花期。B,D,F分别展示了在春化0d（B）、10d（D）、30d（F）条件下TaVrt2-OE、TNL和WT的植株表型。

2.TaVrt2和TaVrn1蛋白互作且主要发生春化过程中。

以前酵母双杂交实验结果显示TaVrt2和TaVrn1能在酵母中互作，但是由于酵母双杂交假阳性太高，因此，分别用pulldown，荧光素互补成像（LCI），双分子互补（BiFC）等验证了它们可以在体外、植物体内以及小麦原生体中物理互作（图2）。

TaVrt2和TaVrn1的表达模式显示，TaVrt2和TaVrn1都能在叶片中大量表达，而且二者的表达都受到春化的诱导。但是在春化结束后，TaVrn1表达持续升高，而TaVrt2的表达量则立即下降（图3）。因此，TaVrt2和TaVrn1都受到春化诱导，而且在春化过程中，TaVrn1和TaVrt2都能大量表达，说明它们主要在春化过程中互作。

图2TaVrt2和TaVrn1的物理互作

证明TaVrt2和TaVrn1在体外互作，GST和MBP空标签用作阴性对照，红色和蓝色实心箭头分别指示TaVrt2-GST和GST，红色和蓝色空心箭头分别指示TaVrn1-MBP和MBP。B.萤光素酶互补成像（LCI）证明TaVrt2和TaVrn1在烟草叶片中互作，nluc和cluc用作阴性对照。C.双分子荧光互补（BiFc）实验证明TaVrt2和TaVrn1在小麦原生质体中互作。cYFP和nYFP用作阴性对照。标尺表示50μm。

图3TaVrt2和TaVrn1的时空表达

A.为TaVrt2和TaVrn1在小麦不同组织和不同时期中的表达量。B.春化处理的方式以及取样时间，V0、V7、V21、V35、V35N7以及V35N21表示春化第0d、7d、21d、35d以及春化35d后的第7d和21d。C.科农199（KN199）,济麦22（Jimai22）和中麦175（Zhongmai175）春化过程中以及春化结束后，TaVrt2和TaVrn1表达量的变化趋势。

3.TaVrt2和TaVrn1存在遗传互作。

为了进一步研究TaVrt2和TaVrn1的关系，在KN199中创制了TaVrn1过表达系（TaVrn1-OE）。表型分析显示TaVrn1-OE在不完全春化条件下，比TNL和WT早开花5-7d左右。TaVrn1-OE和TaVrt2-OE进行了杂交，并在后代分离群体中筛选到了TaVrt2-OE（H-TaVrt2），TaVrn1-OE（H-TaVrn1），TaVrt2+TaVrn1-OE（H-TaVrt2+TaVrn1）以及转基因阴性系（TNL）。表型分析结果显示，在不完全春化的条件下，H-TaVrt2+TaVrn1，H-TaVrt2和H-TaVrn1分别比TNL早开花9.7d，2.4d和4.2d。方差分析显示TaVrt2和TaVrn1存在明显的互作效应（图4）。

图4TaVrt2和TaVrn1的遗传互作

(1)、H-TaVrt2(2)、H-TaVrt2+TaVrn1(3)和转基因阴性植株（NC）中TaVrt2和TaVrn1的表达量。+TaVrn1、H-TaVrt2、H-TaVrn1以及NC在不完全春化条件下开花期统计结果，方差分析显示，TaVrt2和TaVrn1存在明显的遗传互作。C.不完全春化条件下，H-TaVrt2+TaVrn1、H-TaVrt2、H-TaVrn1以及NC开花期的表型差异。

4.TaVrt2和TaVrn1协同调控TaVrn1的表达。

为了研究TaVrt2和TaVrn1协同调控小麦春化开花的机理，对TaVrt2-OE和TaVrn1-OE进行了RNA-seq分析。结果显示，小麦内源的TaVrn1-5DL在TaVrt2-OE和TaVrn1-OE中都发生了上调，而且qPCR显示TaVrn1-5DL在H-TaVrt2+TaVrn1中的上调幅度比H-TaVrt2和H-TaVrn1中更为明显（图5）。TaVrn1-5AL和TaVrn1-5BL并没有在TaVrt2OE和TaVrn1-OE中显著上调（图4），这可能与KN199的TaVrn1基因型有关（vrn1-5AL，vrn1-5AL，Vrn1-5DL），即5AL和5BL是隐性，5DL是显性。以前的研究显示隐性TaVrn1的启动子和内含子含有完整的抑制元件，对其转录具有抑制作用。

图5TaVrn1-OE和TaVrt2-OE转基因系的转录组分析

结果中，TaVrn1-OE和TaVrt2-OE的差异表达基因。B，和TaVrn1-5AL在TaVrn1-OE以及TaVrt2-OE中的相对表达量。在NC、H-TaVrt2、H-TaVrn1以及H-TaVrt2+TaVrn1中的表达量。V0、V10和V10N5分别表示春化0d、春化10d以及春化10d后的第5d。

5.TaVrt2介导了TaVrn1的自我激活

以前的研究显示，TaVrt2能够在体外直接结合TaVrn1启动子上的CArGbox(Kaneetal.,2007)。为了进一步在体内确认这一点，以及研究TaVrn1是否也能直接结合其自身的启动子，分别以TaVrt2-OE（pUBI-TaVrt2-YFP）和TaVrn1-OE（pUBI-TaVrn1-YFP）为材料进行了ChIP-qPCR分析。结果显示，TaVrt2-YFP在TaVrn1-5DL启动子上有显著的富集，但是TaVrn1-YFP在TaVrn1-5DL启动子上富集不显著，说明TaVrt2能够直接结合TaVrn1-5DL的启动子，但是TaVrn1不能直接结合其自身启动子。由于TaVrt2和TaVrn1能够在春化过程中形成复合物，推测TaVrt2介导了TaVrn1的自我激活。

图5.上的5个ChIP-qPCR检测位点，CArGbox是TaVrt2可能的结合位点。和TaVrn1-YFP在TaVrn1上的富集情况。和TaVrn1-YFP在TaVrn1-5AL、TaVrn1-5BL以及TaVrn1-5DL的CArGbox上的富集情况。

以前的研究也显示TaFTL1（TaVrn3）和TaFDL互作可促进TaVrn1的表达，反过来TaVrn1也可促进TaFTL1的表达。本研究的qPCR分析显示它们的互作主要发生在春化后，而TaVrt2和TaVrn1互作对TaVrn1的调控主要发生在春化过程中，据此作者最后提出了一个TaFTL1/TaFDL和TaVrt2/TaVrn1复合物协同调控TaVrn1表达的分子模型（图6）。

2019年11月26日NewPhytologist在线发表了中国农业科学院作物科学研究所“小麦亲本创制和新品种选育团队”（何中虎团队）这一研究成果（DOI:10.1111/）。谢礼博士为该论文的第一作者，通讯作者是曹双河副研究员。该项研究得到国家自然科学基金项目（91935304和3151663），国家重点研发计划（2016ZX08009003和2016YFD0100502）和中国农业科学院科技创新项目的资助。

参考文章

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