【科技名词】蛋白质印迹法（聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫反应）

蛋白质印迹法（dànbáizhìyìnjìfǎ，westernblotting）

学科：细胞生物学_细胞生物学技术

相关名词：聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫反应、抗原抗体复合物

蛋白质印迹法与DNA印迹法或RNA印迹法类似，蛋白质印迹法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的第二抗体。经过PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持被电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质成分。也广泛应用于检测蛋白质水平的表达。

蛋白质印迹法具有以下特点：①将获得的蛋白质样品通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，然后通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印到固相支持物上。固相支持物包括硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜及聚偏氟乙烯（PVDF）膜等。②把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体上，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。③使用的探针是抗体，与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。④作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白质进行鉴别和鉴定。⑤将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法。⑥具有很高的灵敏度，可从总蛋白质中检测出50纳克的特异性表达蛋白。

蛋白质印迹法包括5个步骤：①总蛋白质的提取。针对不同类型的表达细胞，蛋白质的提取方法不同，但要注意保持蛋白质分子的结构完整，因此在提取过程中要注意缓冲液的盐浓度、pH值和温度等，防止目的蛋白质的变性或降解。②SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。③蛋白质印迹。PAGE后将蛋白质转移到固相膜上。印迹使用的固相膜包括硝酸纤维素膜、重氮化纤维素膜、阳离子化尼龙膜和二乙氨乙基（DEAE）-阴离子交换膜等。有电印迹法和被动扩散印迹法等。④探针的制备。探针是针对目的蛋白质的抗体（第一抗体），一般不进行标记，而与第一抗体结合的第二抗体带有特定的标记。这些标记分为放射性和非放射性两类，放射性标记主要采用¹²⁵I、³²P等，非放射性标记主要采用酶，如过氧化物酶和碱性磷酸酶等。⑤杂交和检出。将印迹后的固相膜浸入非特异性蛋白质溶液中，使固相膜上未与蛋白质结合的位点被非特异性蛋白质结合，从而阻止抗体蛋白质与固相膜结合，然后分别加入第一抗体和第二抗体进行反应，最后进行显色反应。